Сейчас специалисты, работающие на переднем крае медицины, связывают большие надежды с развитием нанотехнологии - молекулярной инженерии, которая позволила бы избирательно уничтожать раковые клетки и могла бы привести к разработке прицельной терапии для борьбы с другими вредными клетками, в том числе с анергическими Т-клонами.

Один из подходов в этой области использует дендримеры - древовидные полимеры со сложной ветвящейся структурой, образующей крошечную сферическую частицу.

Ветви дендримеров сконструированы таким образом, что могут присоединять разнообразнейшие молекулы.

В результате они аналогичны универсальному складному ножу: множество инструментов в одной компактной упаковке. Дендример может нести одновременно молекулу, нацеливающую его на определенный тип клеток, один или несколько токсинов для уничтожения этих мишеней плюс (если надо) метку, позволяющую ученым или врачам следить за миграцией по организму всего этого набора.

Один из испытываемых сейчас дендримеров загружен фолиевой кислотой (витамином В9), противораковым агентом метотрексатом и флуоресцентным красителем флуоресцеином. Витамин нужен для наведения этой бомбы на раковые клетки. Многие из них жадно поглощают фолат, поскольку он нужен для синтеза ДНК - процесса, особенно интенсивно идущего при злокачественном росте, подразумевающем частые клеточные деления с предшествующим копированием генетического материала. Для удовлетворения своих потребностей в этом витамине многие раковые клетки "обучаются" выращивать на своей поверхности целые леса из связывающих его рецепторов.

Описанный дендример испытывался на мышах, которым привили носоглоточный рак человека. Эти опухоли быстро росли, примерно через 50 суток достигая плато своего увеличения. Когда одной группе таких животных вводили низкие дозы метотрексата, терапевтического эффекта практически не наблюдалось. Доза, в четыре с лишним раза превышающая первую, существенно замедлила развитие опухолей, однако не принесла особой пользы животным: половина из них в течение 39 дней умерла либо от самого рака, либо от побочных эффектов лечения. Увеличение дозы еще на 50% почти остановило злокачественный рост, но опять же тяжело отразилось на пациентах: мыши быстро потеряли треть массы тела, и половина их за месяц эксперимента погибла.

Совсем иная картина наблюдалась при нацеливании того же самого медикамента с помощью дендримера. Минимальная из испытанных в предыдущем опыте доз метотрексата замедляла в данном случае рост опухоли так же, как и средняя, демонстрируя при этом намного более низкую токсичность.

В следующем исследовании та же группа сравнивала эффекты минимальной дозы чистого метотрексата и той же дозы, нацеливаемой дендримером, в течение более длительного периода - 99 суток. Не получавшие лечения мыши начали погибать примерно через 50 суток. Чистый метотрексат улучшил выживаемость незначительно. Зато лекарство, нацеленное дендримером, позволило дожить до конца эксперимента 38% животных. Что особенно впечатляло: одно из них за 39 суток полностью вылечилось от рака. Опять же, дендримерное нацеливание метотрексата делало его нетоксичным.
Замена пилы зубочисткой
Ценность дендримеров, как и универсального ножа, в их легкой адаптации к разнообразным задачам. В экспериментах исследователи присоединяют к ним всевозможные нацеливающие молекулы и противораковые агенты. Один из наиболее остроумных вариантов такого подхода - "дендримеризация" борной нейтрон-захватной терапии (БНЗТ). Принцип такого лечения был впервые предложен более полувека назад, но применить его на практике до сих пор не удавалось.
БНЗТ несколько напоминает фотодинамическую терапию. Сначала пациенту вводят изотоп бора.

Когда раковые клетки накапливают достаточные его количества, человека облучают низкоэнергетическим потоком нейтронов. И применяемый бор, и нейтроны сами по себе для нас практически безвредны. Однако когда ядра изотопа сталкиваются с потоком этих частиц, они поглощают их, становясь крайне нестабильными (радиоактивными), и начинают испускать жесткое альфа-излучение. Оно губит содержащие бор клетки и их ближайших соседей, но быстро теряет энергию и становится безопасным для остального организма. Результат - высокоизбирательное воздействие с минимальным побочным эффектом.

Естественно, самым сложный момент борной нейтрон-захватной терапии - введение бора исключительно в раковые клетки, чтобы после приема его изотопа нейтронное облучение не вредило здоровым тканям. С 1951 ученые пытались использовать такой метод против редкой, крайней агрессивной и плохо поддающейся лечению формы рака головного мозга, так называемой мультиформной глиобластомы. До сих пор достигнутые успехи были невелики и не позволяли превратить БНЗТ в стандартный метод лечения этой болезни.

Однако недавно в опытах на животных с мульформной глиобластомой дендримерное нацеливание бора позволило получить весьма многообещающие результаты. В головной мозг крыс имплантировали человеческие глиобластомные клетки с третьей мутантной версией рецептора эпидермального фактора роста (РЭФР), известной как РЭФРвШ, которая встречается в большинстве случаев такого рака. Затем дендримеры загружали бором, прикрепляли к ним нацеливающие агенты - моноклональные тела к РЭФРвШ - и натравливали эти агрегаты на опухоли, т.е. просто вводили больным животным.

Для более четкой демонстрации преимуществ нового метода его результаты сравнивали с состоянием целых трех контрольных групп: одна из них не получала никакого лечения, во второй крысам давали n-борфенилаланин (БФА), давший наилучшие результаты в прежних версиях БНЗТ, а в третьей - загруженные бором дендримеры в сочетании (но без химической связи) с БФА. В течение суток около 60% введенной дозы дендримеров, несущих БФА, связалось с мутантными рецепторами раковых клеток.

Это обеспечило примерно втрое более высокую противоглиомную концентрацию активного вещества, чем при использовании одного борфенилаланина. Захват обоих лекарств нормальными тканями был пренебрежимо слабым. Вдохновленные таким удачным нацеливанием, исследователи стали ждать результатов собственно лечения.

Эти результаты были однозначными. Не получавшие никакого лечения животные жили в среднем 26 дней. Использование БФА продлевало этот срок до 40 суток: существенное улучшение, но все же грустный прогноз. Крысы, получавшие бор, нацеленный денримерами, жили в среднем 70 дней, причем некоторые из них не умирали полгода и считались "выздоровевшими" (по аналогии с лечением, обеспечивающим пятилетнее выживание раковых людей, поскольку продолжительность жизни здоровых крыс около 30 месяцев).

Если же животным вводили нагруженные бором дендримеры вместе с БФА, средняя продолжительность жизни достигла целых 85,5 дней. Это в три с лишним раза превысило показатель, наблюдавшийся без всякого лечения, и более чем вдвое - результат применения лучшего на сегодняшний день экспериментального варианта БНЗТ. Кроме того, 20% крыс, получавших борфенилаланин вместе с дендримерами, "выздоровели" в соответствии с указанным выше критерием.

На экспериментальных моделях были успешно испытаны дендримеры с различными нацеливающими и противораковыми агентами. Это первое поколение нанотехнологических лекарств четко продемонстрировало: у нас есть высокоэффективный и гибкий способ точечной бомбардировки злокачественных клеток с известными поверхностными рецепторами, который в принципе применим и для уничтожения анергических Т-лимфоцитов.
Доведение до самоубийства
В наши дни генная терапия широко применяется на подопытных мышах: с ее помощью тестируют аналогичные способы лечения людей, исследуют эффекты включения и выключения отдельных генов, моделируют человеческие болезни, модифицируя мышиные клетки для придания им большего сходства с нашими. Практическое использование генной терапии в обычных больницах, судя по результатам экспериментов, - всего лишь вопрос времени.

Ее необходимость для лечения врожденных болезней и потенциальная польза при широком спектре других медицинских проблем, включая СПИД, ревматоидный артрит, травмы и реконструкция зубной ткани (список можно продолжить), - достаточные стимулы, чтобы продолжать фундаментальные и клинические исследования, которые довели бы до ума соответствующие методики.

Один из вариантов такой генной терапии - встраивание в наши Т-клетки нового суицидального (апопотозного) механизма, включающегося с приобретением ими анергичности. Ученые уже научились вводить мышам (и другим лабораторным животным) гены, активируемые только в присутствии определенного фактора - антибиотика, ультрафиолета, сахара или даже повышенного уровня кальция. Фактически это позволяет нам произвольно включать и выключать специфические клеточные функции.

Введение в клетку экспрессируемых по желанию исследователей генов до сих пор было лишь мощным инструментом изучения их эффектов. Однако сейчас всерьез рассматривается применение этого подхода в медицинских целях. Если эти гены будет активироваться не внешними факторами, а определенным белком, внутренний синтез которого характерен для нежелательных нам клеток, фактически мы получим новый способ их избирательного уничтожения.

Как и в случае других, обсуждавшихся выше прицельных методик, первыми разработкой такого подхода занялись онкологи. Уже говорилось, что для роста раковой опухоли ее клеткам необходима способность восстанавливать свои теломеры. Иначе в ходе частых клеточных делений эти структуры быстро исчезнут - задолго до возникновения серьезной угрозы для нашего здоровья. Обычно такая способность возникает в результате активации отключенного гена, кодирующего фермент теломеразу.

Этот ген присутствует во всех наших клетках, но рано или поздно инактивируется и уже никогда или большую часть времени никак себя не проявляет. Следовательно, "заражая" клетки пациента "суицидальным геном", который включался бы при повышении уровня теломеразы, мы снабжали бы их внутренним механизмом самоуничтожения. Это избавило бы нас от необходимости нацеливать на раковые клетки лекарства или иммунную систему. Образно говоря, враг, едва решившись на агрессию, сам накладывал бы на себя руки.

В принципе, создать "суицидальный ген", разрушающий клетку при наличии в ней определенного белка, вполне возможно. Фактически это уже делалось у лабораторных животных с экспериментальными раковыми опухолями при помощи регулирующих апоптоз генов. Невосприимчивость к апоптозным сигналам анергических Т-лимфоцитов можно преодолеть, упорно бомбардируя их приказами покончить с собой.

Однако одна из разрабатываемых сейчас альтернатив намного перспективнее. Она использует легче контролируемый - и, следовательно, более безопасный - способ введения в клетку гена, кодирующего белок, который сам по себе практически безвреден, но активирует так называемое "пролекарство", т.е. неактивную форму смертельного медикамента.

Пролекарства - это вещества, требующие для своего терапевтического действия определенной формы метаболизации организмом, т.е. химического превращения в фармакологически активное соединение. Большинство пролекарств активируется ферментами нашей печени, выпускающей в кровоток их полезные нам производные. Другие больше похожи на так называемых "спящих агентов": они незаметно распространяются по всему организму и "залегают на дно" до тех пор, пока не получат заранее оговоренного сигнала, который заставляет их действовать, т.е. прицельно поражать свои мишени.

Примерно так работают некоторые антивирусные средства, например ганцикловир (Цитовен/Цимевен), используемый против герпеса. Он останавливает размножение вируса, не давая тому пользоваться необходимой для этого системой репликации ДНК клетки-хозяина. Говоря более конкретно, лекарство подавляет действие вирусного варианта тимидинкиназы (ТК), участвующего в синтезе ДНК фермента.

ТК готовит азотистое основание тимин (одну из "букв" генетического кода) к встраиванию в цепочку ДНК путем фосфорилирования, т.е. присоединения к его производному, тимидину, фосфатной группы, отделяемой от молекулы АТФ - нашей "энергетической валюты". Ганцикловир ведет себя как молекулярный двойник ценного сотрудника, внедренный для диверсии на вражеское производство. Благодаря структурному сходству с тимидином он обманывает вирусную тимидинкиназу, которая по ошибке фосфорилирует лекарство.

После этого ганцикловир-фосфат продолжает свое черное дело, выдавая себя за тимидин-фосфат на сборочном конвейере ДНК и встраиваясь в ее синтезируемую цепочку. Задача внедренного агента выполнена: оказавшись в составе растущей молекулы, он останавливает ее дальнейшее удлинение. В результате вирус не может копировать свою ДНК, а значит размножаться. Его атака на организм прекращается. Иммунной системе остается лишь обнаружить и уничтожить немногочисленные клетки, в которых он прячется, никак не влияя на наше здоровье.

Если бы ганцикловир умел так же ловко обманывать не только вирусный, но и наш собственный, человеческий вариант ТК, его можно было бы с успехом использовать как противораковое средство. Злокачественные клетки становятся опасными за счет своего быстрого размножения. Значит, нарушив необходимый для клеточного деления синтез ДНК, можно эту опасность ликвидировать.

Естественно, такой подход чреват серьезнейшими побочными эффектами, поскольку он одновременно нарушал бы необходимое организму размножение его нормальных клеток. В случае рака с таким ущербом еще можно было бы смириться - пациент оправился бы от него после отмены укротившего опухоль лекарства. Однако при борьбе с вирусом того же герпеса этот вариант абсолютно неприемлем.

В любом случае ганцикловиру редко удается провести человеческую тимидинкиназу, поэтому он подавляет в основном репликацию вируса, хотя и несколько ухудшает у пациента регенерацию клеток крови и выработку сперматозоидов. Однако недавно группа японских и американских ученых продемонстрировала, что систему вирусная ТК/ганцикловир в принципе можно использовать для подавления рака. Надо лишь научиться с помощью генной терапии вводить этот фермент во все клетки пациента, но включать его только в злокачественных.

Как уже говорилось, одно из характерных отличий раковых клеток от нормальных, которое можно было бы использовать для избирательной активации вирусной ТК - присутствие активной теломеразы. Присоединив ген этой тимидинкиназы к "пусковому механизму" (промотору), включающему транскрипцию только при наличии теломеразы, мы заставили бы вирусный фермент останавливать деление злокачественных клеток, тогда как почти во всех остальных он вообще не синтезировался бы.

Описанная схема напоминает биотехнологический эквивалент одного из хитроумных многоступенчатых приспособлений, которые используются в настольной игре "мышеловка". Ученые ставят свою "ловушку", сначала засевая все клетки пациента копиями гена, кодирующего вирусную ТК, в совокупности с реагирующим на теломеразу промотором. После этого пациент глотает таблетки ганцикловира, который опять же неизбирательно проникает во все его клетки.

В подавляющем большинстве из них лекарство никак себя не проявляет, поскольку почти по всему человеческому организму теломераза отсутствует. Однако, когда ганцикловир попадает в раковую клетку, ловушка срабатывает. Присутствующая там теломераза запускает образование вирусной тимидинкиназы; та фосфорилирует ганцикловир, делая его пригодным для присоединения к растущей копии клеточной ДНК; синтезирующий ее фермент (ДНК-полимераза), принимая ганцикловир-фосфат за тимидин-фосфат (нормальную "букву" генетического кода), встраивает лекарство в незавершенную цепочку ДНК. В этот момент пора кричать: "Мышеловка!", поскольку дальнейший синтез ДНК становится невозможным, клеточное деление - тоже, и рост раковой опухоли прекращается.

Схема сложная, но она действовала в пробирочных экспериментах на раковые клетки печени, почек, поджелудочной и щитовидной желез. Более того, была доказана ее практическая безопасность для нормальных клеток крысиной щитовидки и человеческой кожи. В результате ученые перешли к следующему этапу ее реализации - клиническому испытанию на лабораторных животных.

Сначала они изготовили две партии гена вирусной ТК: у одной промотор активировался теломеразой, а у другой должен был "включаться" как в раковых, так и в нормальных клетках. Потом они ввели такие молекулярные конструкции в вирусы того же семейства, что и возбудители обычной простуды, позволив им буквально заразить животных генетическими "ловушками". Первыми получили их здоровые особи - для проверки потенциальных побочных эффектов. Как и ожидалось, вирусная тимидинкиназа, синтезируемая с участием неизбирательного промотора, после инъекции ганцикловира привела к тяжелому поражению печени. Если же ее ген был связан с промотором, активируемым теломеразой, отрицательных последствий практически не наблюдалось - впрочем, как и положительных, поскольку раковые клетки, экспрессирующие теломеразу, тоже отсутствовали.

После этого ученые перешли к следующей стадии испытаний: тестированию этой терапии на животных с имплантированными клетками человеческой карциномы щитовидки. Когда им ввели ген вирусной ТК с промотором, активация которого не зависит от присутствия теломеразы, рост опухоли полностью остановился, но, как и ожидалось, это одновременно не дало размножаться нормальным клеткам, что привело к тяжелому поражению печени.

Однако при избирательном нацеливании вирусной тимидинкиназы на раковые клетки с помощью зависимого от теломеразы промотора ганцикловир прекратил рост опухоли так же эффективно, как и в предыдущем случае, но без наблюдавшегося при этом токсичного эффекта. Безопасность такого высокоселективного подхода становится еще более убедительной, если вспомнить, что вирусную ТК можно включать и выключать, соответственно вводя ган-цикловир и прекращая его применение.

Ди Грей Обри

medbe.ru